0512-86860966
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摘要
大腸桿菌群(coliform)多存在于溫血動物之糞便、人類活動之場所及有糞便污染的地方，常被作為食品 被糞便污染之指標(biāo)。近年來，ISO 機(jī)構(gòu)提出以腸桿菌科傾注平板檢驗方法取代大部分食品的大腸桿菌群MPN 法作為衛(wèi)生指標(biāo)菌，而臺灣衛(wèi)福部食品藥物管理署亦于 2018 年 8 月公告腸桿菌科檢驗方法之草案。 為了評估新公告之草案與其它兩種大腸桿菌群檢驗方法(臺灣之大腸桿菌群 MPN 法及中國大陸國標(biāo)大腸 桿菌群直接平板法)之效能，本研究利用 15 件手搖飲料檢體及 2 件標(biāo)準(zhǔn)菌種的對照組進(jìn)行三種方法檢驗結(jié) 果的比較。利用不同稀釋濃度的檢液及培養(yǎng)基等進(jìn)行評估，培養(yǎng) 24 小時后，計數(shù)及接續(xù)進(jìn)一步鑒定。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)其中有5個檢體為未檢出和2件陽性飲料檢體MPN法超過1,100 MPN/g，因此，不能作為比較之用， 本研究以介于未檢出及大量檢出中間的 8 件陽性檢體進(jìn)行生長的菌數(shù)多寡比較，結(jié)果指出以新公告腸桿菌 科草案所獲得的腸桿菌科菌數(shù)比其它兩種大腸桿菌群方法所獲得的菌數(shù)高，此說明衛(wèi)福部新公告方法作為 衛(wèi)生指標(biāo)菌有其意義及重要性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)市售手搖飲料大腸桿菌群或腸桿菌科衛(wèi)生指標(biāo)菌檢測不 合格率高達(dá)66.7% (10/15)，值得衛(wèi)生主管單位作為稽核及加強(qiáng)從業(yè)人員衛(wèi)生教育的參考。
關(guān)鍵詞:腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、大腸桿菌群、MPN 法、衛(wèi)生指標(biāo)菌
前言
腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是指在適 當(dāng)條件下發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性的需 氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。細(xì)菌 學(xué)上將腸桿菌科的細(xì)菌分為 20 個菌屬，包括Escherichia(埃希氏菌)、Shigella(志賀氏 菌)、Salmonella(沙門氏菌)、Citrobacter(檸檬酸桿菌)、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterobacter(腸桿菌)、Serratia(沙雷氏
菌)、Hafnia(哈夫尼氏菌)、Edwardsiella(愛德華氏菌)、Providencia(普羅威登斯 氏菌)、Proteus(變形桿菌)、Morganella(摩根氏菌)、Yersinia(耶爾森氏菌)等[1]。
大腸桿菌群(coliform)并非指特定菌株， 而是指一群在人體腸胃道內(nèi)有相同生理活性 的菌群。在細(xì)菌學(xué)上的意義為一群好氧或兼 性厭氧且能在 37°C下分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革 蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要包括檸檬酸桿菌(Citrobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、腸 桿菌(Enterobacter)、大腸桿菌(Escherichiacoli);但不包括非乳糖發(fā)酵型的食品病原菌 (例如:沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌 等)，因此不夠明確表示出食品加工后的衛(wèi) 生狀況[1]。
長久以來，食品衛(wèi)生中以指標(biāo)菌作為食 品安全及質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)無法檢測食品中每 種有害微生物時，只針對某些特定指標(biāo)菌作 為是否合乎衛(wèi)生要求之指標(biāo)，如:總生菌數(shù)、 大腸桿菌群、大腸桿菌。目前臺灣檢驗大腸 桿菌群使用的 MPN 法只是估計值，并不是很 精確，且大腸桿菌群只能檢測乳糖發(fā)酵型食 品病原菌。
2018 年 8 月衛(wèi)福部提出腸桿菌科的檢驗 方法草案，因為腸桿菌科包括所有能夠發(fā)酵 葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性的革蘭氏陰性無芽 孢桿菌，涵蓋的種類較大腸桿菌群為多，也 包括了病原菌，除了大腸桿菌群的乳糖發(fā)酵 型細(xì)菌，還包含許多非乳糖發(fā)酵型細(xì)菌(如 變形桿菌及其它相近菌種)，能夠確切呈現(xiàn) 較實際的污染程度[1]。
本研究主要目的是將臺灣腸桿菌科直接 平板檢驗方法草案與大腸桿菌群 MPN 法、大 陸國標(biāo)大腸桿菌群直接平板檢驗方法做比較， 想了解市售飲料中大腸桿菌群及腸桿菌科的 偵測以不同方法及培養(yǎng)基進(jìn)行，產(chǎn)生之?dāng)?shù)據(jù) 會有何差異。
材料及方法
試驗材料
本研究主要是初步評估 2018 年 8 月 1 號衛(wèi) 生局福利部食品藥物管理署訂定之腸桿菌科 檢驗方法草案與原先公告的大腸桿菌群 MPN法、大陸國標(biāo)大腸桿菌群檢驗方法這三者的 效能差異，共檢測 15 件檢體，均為手搖飲料。
試劑與耗材
根據(jù)臺灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平板檢驗、大陸國標(biāo)大腸桿菌群直 接平板檢驗所需的稀釋液(磷酸緩沖溶液、 緩沖蛋白胨水)、選擇性增菌液(Lauryl sulfate tryptose broth、brilliant green lactose bile broth)、選擇性分離培養(yǎng)基(VRBGA、VRBA)及滋養(yǎng)培養(yǎng)基(Blood agar plate，BAP)皆購 自啟新生物科技有限公司(新北市，臺灣)。 培養(yǎng)基均經(jīng)無菌性試驗與培養(yǎng)基效能(即滋 養(yǎng)性、增菌性、選擇性與區(qū)分性相關(guān)效能) 試驗確認(rèn)質(zhì)量。
菌株制備
本研究的品管對照菌株為 Enterobacter cloacae ATCC 13047 及 Escherichia coliATCC 25922 作為培養(yǎng)基效能測試的對照組 菌種，將兩菌株接種至 BAP 培養(yǎng)于 35±1°C 一般培養(yǎng)箱中 18~24 小時，之后接種第二次 達(dá)到生化/生理特性的活化效果。
菌液制備
將欲得到預(yù)估菌量的菌液滴至無菌培養(yǎng) 皿進(jìn)行傾注平板法作為基準(zhǔn)，首先以接種環(huán) 挑取活化后之菌株于 0.85%之 5 mL TSB 中 調(diào)整菌液濃度至相當(dāng) McFarland no. 0.5 標(biāo)準(zhǔn) 液，以分光亮度計測量 Enterobacter cloacae及 Escherichia coli 之 OD 值分別為 0.082 及0.088，再從菌液使用吸管取 1 mL 菌液加入9 mL 滅菌飲料進(jìn)行序列稀釋至 106 倍，隨后 進(jìn)行效能比較試驗。
臺灣公告之大腸桿菌群 MPN 法[2]:此方 法是檢體經(jīng)序列稀釋后，以三階三管進(jìn)行培 養(yǎng)，并進(jìn)行 MPN 計數(shù)。操作時，秤取 50 g飲料檢體加入 450 mL 磷酸緩沖溶液(Phosphate buffer，pH 7.2)，即為 10 倍稀釋液。再以 90 mL 磷酸緩沖溶液進(jìn)行 10 倍序列稀釋后，分 別吸取 1 mL 稀釋液(1:10，1:100 及 1:1,000)注入裝有發(fā)酵管的 Lauryl sulfate tryptose broth (LST)各三支，在 35°C一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~48 小時后，若發(fā)酵管內(nèi)有氣體產(chǎn)生則為 大腸桿菌群推定陽性。自陽性試管內(nèi)取一接 種環(huán)液體至 brilliant green lactose bile broth (BGLB)，在 35°C一般培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24~48 小 時后，產(chǎn)氣者為大腸桿菌群陽性，計算 BGLB陽性反應(yīng)試管數(shù)，查 MPN 表，最后計算大腸 桿菌群之最確數(shù)，以 MPN/g 表示。
臺灣公告腸桿菌科直接平板檢驗法[3]: 檢體經(jīng)系列稀釋后，以傾注選擇性平板培養(yǎng) 基培養(yǎng)及計數(shù)之方法。秤取 50 g 飲料檢體加 入 450 mL 緩沖蛋白胨水(BPW)，即為 10 倍 稀釋液。再以 90 mL 緩沖蛋白胨水進(jìn)行 10 倍 序列稀釋后。取 1 mL 稀釋檢液至無菌培養(yǎng) 皿，二重復(fù)，再倒入 10~15 mL 的 violet red bile glucose agar (VRBGA)，以 8 字方式搖 勻，將培養(yǎng)基與檢液充分混勻，待培養(yǎng)基凝 固后，再加 3~4 mL VRBGA 覆蓋平板表層， 防止蔓延生長并使菌落特征更為明顯。然后 將凝固后的平板置于 37°C一般培養(yǎng)箱，倒置 培養(yǎng) 24±2 小時后，計數(shù)平板上菌數(shù)量(計數(shù) 介于 15~150 菌落數(shù))。典型菌落為有或無沉 淀環(huán)的粉紅色至紅色或紫色菌落。從 VRBGA平板上至少挑取 5 個(少于 5 個全選)典型 菌落進(jìn)行確認(rèn)。其方式為分別將所挑選的每 一個菌落，四區(qū)劃線于 BAP，置于 37°C一般 培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 24±2 小時后，挑取單一菌 落進(jìn)行 MALDI-TOF MS 的鑒定。
大陸國標(biāo)大腸桿菌群直接平板檢驗法[4]: 檢體經(jīng)系列稀釋后，以傾注選擇性平板培養(yǎng) 基培養(yǎng)及計數(shù)之方法。取 50 g 飲料檢體，其 無菌稀釋液及稀釋方法與臺灣 MPN 法相同。 取 1 mL 稀釋檢液至無菌培養(yǎng)皿，二重復(fù)， 再 倒 入 15~20 mL 的 violet red bile agar (VRBA)，8 字搖勻，將培養(yǎng)基與檢液充分混 勻，待培養(yǎng)基凝固后，再加 3~4 mL VRBA覆蓋平板表層。然后將凝固后的平板置于36±1°C一般培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 18~24 小時 后，計數(shù)平板上菌數(shù)量(計數(shù)介于 15~150 菌落數(shù))。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅 色膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。 從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型 和可疑菌落，少于 10 個菌落時，則挑取全部 典型和可疑菌落。分別移種于 BGLB，在36±1°C的一般培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24~48 小時后，產(chǎn) 氣者為大腸桿菌群陽性。
MALDI-TOF MS 鑒定腸桿菌科[5]
選取 MSP 96 凹槽靶板(96-wells
target
plate)的一個凹槽滴加 Bruker 細(xì)菌測試標(biāo)準(zhǔn)(bacterial test standard)， 風(fēng) 干 后 即 可 進(jìn) 行Microflex LT 儀器校正，然后分別以滅菌牙 簽挑取適量的預(yù)檢測菌落到 MSP 96 靶板的 各個測試凹槽上，待干燥，將測試凹槽以 1
L 的 70% formic acid(甲酸)(Sigma, USA)覆蓋后，干燥，最后滴加 1 SHAPE \* MERGEFORMAT
L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液 SHAPE \* MERGEFORMAT
結(jié)果
檢測 15 件飲料檢體及兩組對照組進(jìn)行臺 灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平 板檢驗方法與大陸國標(biāo)大腸桿菌群直接平板 檢驗方法后，若呈陽性，則取 15-150 CFU 計 數(shù)范圍內(nèi)之培養(yǎng)基進(jìn)行計數(shù)(圖 1)，并分 別取 5 個或 10 個可疑菌落進(jìn)行純化，再進(jìn)行MALDI-TOF MS確證，最后代入公式計算。15 件檢體中扣除三種方法均未檢出的 5件檢體以及 2 件 MPN 法超過 1,100 MPN/g,因此，不能作為比較之用，本研究以介于未 檢出及大量檢出中間的 8 件陽性檢體進(jìn)行 3種方法測試結(jié)果的比較，結(jié)果如表 1。又本 研究另外發(fā)現(xiàn)手搖飲料以三種方法檢驗之衛(wèi)
生不合格率均高達(dá) 66.7%(10/15)
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討論
檢體的成分不同，可能會影響方法之效 能，因此需要額外做一組對照組。標(biāo)準(zhǔn)菌株 之預(yù)估菌量為 1.5×108 CFU/mL，在三種方 法下檢測到的菌量皆約為 107 CFU/mL，由 此可看出無明顯差異，而 MPN 法中無法得到 準(zhǔn)確菌數(shù)。本研究所使用的檢體 11~15 皆無 陽性產(chǎn)氣管及菌落生長，因此取無菌之飲料后作為調(diào)菌基質(zhì)，進(jìn)行對照組之確認(rèn)。檢體1、檢體 3、檢體 4 及檢體 8 在大陸國標(biāo)大腸 桿菌群、臺灣腸桿菌科之方法中菌數(shù)皆落在102 CFU/g，但在 MPN 法只偵測到 43 MPN/g(95%信賴區(qū)間為 9~180 CFU)，由此可看 出 MPN 法檢出的菌數(shù)比其他兩種方法低。另 外，檢體 2、檢體 5、檢體 6 及檢體 7 之檢出 菌數(shù)以臺灣腸桿菌科方法最高，其次為大陸 國標(biāo)大腸桿菌群，而以 MPN 法最低。
臺灣腸桿菌科檢驗方法偵測之菌數(shù)最多， 是因腸桿菌科包含 42 個菌屬，涵蓋范圍大， 其中就包含衛(wèi)生指標(biāo)菌及常見病原菌，例如 大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、阪崎腸桿 菌等。此方法中所使用的 VRBGA(結(jié)晶紫 中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂)組成分中含有乳糖 和葡萄糖，因此，VRBGA 適用于所有腸桿 菌科菌種的分離。大陸大腸桿菌群檢驗方法 所使用的 VRBA(結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂) 與 VRBGA 之組成分有些微差異，VRBA 僅 含有乳糖，適用于乳糖發(fā)酵型細(xì)菌的分離。 因此此方法能偵測到之菌數(shù)會比腸桿菌科還 要少。
最后，MPN 法屬于半定量法，透過大腸 桿菌群之生理功能判斷此菌的存在及數(shù)量， 判讀后，查 MPN 表，推算出來的數(shù)據(jù)僅為統(tǒng) 計估計值，有其信賴區(qū)間，但無法得到準(zhǔn)確 之?dāng)?shù)據(jù)。若要以 MPN 法與直接平板法做比 較，以直接平板法所獲得的菌數(shù)較高，且在24 小時內(nèi)可獲得結(jié)果。
根據(jù) MALDI-TOF MS 確證之結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)VRBA中可生長之菌種包含Rahnella aqua- tilis、Pantoea agglomerans、Enterobacter asburiae、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Serratia plymuthica、Erwinia persicina、Ewingella americana、Bacillus clausii，其中 Bacillus clausii 屬于芽孢桿菌 科，主要是因為其可利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸， 因此可在 VRBA 生長。而 VRBGA 除了上述 菌種以外，還鑒定出葡萄糖非發(fā)酵菌中的Achromobacter xylosoxidans，此可能是因為 此菌可氧化利用葡萄糖之故。由此可知，VRBA 及 VRBGA 除了大腸桿菌群及腸桿菌 科可生長外，也可能會有其他菌種生長。
中國國標(biāo)中腸桿菌科檢驗方法可分成MPN 法及傾注平板法，ISO 另外公告食品之 腸桿菌科檢驗法以直接平板法取代 MPN 法 后，許多國家隨后跟進(jìn)訂定相關(guān)公告方法，臺灣于 2018 年 8 月也提出草案。各國皆以直 接平板法為主要之食品衛(wèi)生指標(biāo)菌，但可能 是因為 MPN 法過程繁瑣，從采樣至最終報告 所需時間較長，因此臺灣之腸桿菌科檢驗方 法僅公告直接平板法，而沒有 MPN 法。
本研究發(fā)現(xiàn)手搖飲料以三種衛(wèi)生指標(biāo)菌 檢測方法檢驗的結(jié)果，衛(wèi)生不合格率高達(dá)66.7%(10/15)，然而，其中 60%(6/10) 的大腸桿菌群菌數(shù)低于 100 MPN/g(mL)，若 以 Petrifilm E. coli/coliform count plate 檢 測，將僅能檢測 22.7%[6]。
綜合上述結(jié)果，15 件檢體中以臺灣衛(wèi)福 部公告腸桿菌科的直接平板法效能最佳(獲 得菌數(shù)最高)，因為培養(yǎng)基之成分可供較多 革蘭氏陰性菌、葡萄糖發(fā)酵型細(xì)菌生長，而 大陸國標(biāo)大腸桿菌群之直接平板法所使用的 培養(yǎng)基成分僅限于乳糖發(fā)酵菌的生長，因此 生長的菌種較少，最后 MPN 法若是大腸桿菌 群菌量過多的情況下，將無法準(zhǔn)確得知其菌 量。
參考文獻(xiàn)
